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構造細胞生物学のための電子顕微鏡技術 8.単離した分子を見る

電子顕微鏡というイメージからすると分子を見ることは何でもないように思えるが、実際は難しい。確かに分解能的には十分であるが、蛋白質をはじめ生体を形成する分子は全て軽元素から構成されており、電子線を十分散乱させることができない。
電子顕微鏡のコントラストは主に電子線の散乱により形成されるので(amplitude contrast)、散乱が起こらないと像が観察されないことになる。また、蛋白質分子のように試料が小さいとピントをずらすことによる位相差像もぼけの中に埋没してしまい期待できない。合わせて、真空中で観察しなければならないことおよび電子線による照射ダメージを考えると精製蛋白質をそのままグリッドに載せ観察することは不可能に近い。したがって、簡単に見るためには染色剤で分子の周りを固めたり(ネガティブ染色)、白金蒸着したりして観察することになる(低角度回転蒸着法:low angle shadowing)。 ここでは主にこれら2つの方法について紹介する。

(1)ネガティブ染色(negative staining、負染色)

精製したタンパク質あるいは複合体を高分解能で観察できる簡便な方法である。
単粒子解析などの画像処理法と組み合わせると数ナノメートルの分解能で立体像を予測できる。カーボン支持膜などを張ったグリッド(メッシュ)に試料を吸着させ、酢酸ウラン、燐タングステン酸などの染色剤をのせる。余剰の染色剤を濾紙で吸い取り、乾燥と同時に試料の周りを染色剤で固める方法である。
試料より周囲の染色剤の方が電子線を散乱するで、試料は白く浮かび上がる。すぐに観察でき分解能の高い像を得ることができるが、自然乾燥であること、染色剤の被覆の相違により像が変化することなどを考慮し、像の解釈には十分注意する必要がある。

準備するもの:

  • 精製蛋白質などの試料
  • 2%酢酸ウラニウム水溶液
  • 膜張グリッド
  • 扇型に切った濾紙
  • ピンセット
  • ピペットマン

精製したタンパク質あるいは複合体を高分解能で観察できる簡便な方法である。
単粒子解析などの画像処理法と組み合わせると数ナノメートルの分解能で立体像を予測できる。カーボン支持膜などを張ったグリッド(メッシュ)に試料を吸着させ、酢酸ウラン、燐タングステン酸などの染色剤をのせる。余剰の染色剤を濾紙で吸い取り、乾燥と同時に試料の周りを染色剤で固める方法である。
試料より周囲の染色剤の方が電子線を散乱するで、試料は白く浮かび上がる。すぐに観察でき分解能の高い像を得ることができるが、自然乾燥であること、染色剤の被覆の相違により像が変化することなどを考慮し、像の解釈には十分注意する必要がある。

カーボン膜張グリッドの作製:

プロトコール:

  1. 試料溶液を膜張グリッド上に載せ、10分間程度静置し、試料分子を膜面に吸着させる。図2のようにグリッド上に試料滴を盛る方法とパラフィルム上に試料滴を作り、そこにグリッドを被せる方法の2通りがある。
    また、最終的に試料の周囲に残留する染色剤の量を最適化するためと、キャリブレーションのために、タバコモザイクウイルスを試料に混合する人もいる。
  2. 試料溶液とほぼ同量の2%酢酸ウラニウム水溶液をたらし、試料液を洗い落とす。
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  4. パラフィルム上に2%酢酸ウラニウム水滴を2つ用意し、試料側が水滴に接するように被せる。2つの酢酸ウラニウム水滴にそれぞれ1秒位づつ接触させる。
    (これは試料周囲の染色剤の純度を上げることと、コンタミを洗浄することの2つの意味がある)
  5. 濾紙で余剰の染色剤を吸収し、自然乾燥させ、電子顕微鏡で観察する(図2)。

ネガティブ染色では分子の輪郭が観察されるのであり、染色剤が中にしみ込まない限り内部は見えないはずであるが(図3)、染色剤と試料との関係は様々で、それにより見え方も多少異なる。
一般に粒子の半分より下が染色剤で覆われているほうが表面構造を鮮明に観察できる。全体に染色剤で覆われると上面と下面の構造が重なり解析が難しくなることもある(図3)。特に、両面とも規則正しい構造が含まれているとモワレにより全く関係ない模様が現れることもある。
また、試料の物性により部分的にポジティブ染色が加わることもある。分解能が高いだけ構造解析は慎重に行うべきである。図4に応用例として微小管の染色像を掲げる。

DearOne、レディースファッション通販サイト「GRL(グレイル)」公式サイトに行動分析ツール『Amplitude』と、カスタマーエンゲージメントツール『MoEngage』を国内初導入

株式会社NTTドコモのマーケティング分野における新規事業型子会社である株式会社DearOne(本社:東京都港区、代表取締役:河野恭久、以下:DearOne)は、アートデコ株式会社(本社:大阪府大阪市、代表取締役:二宮 潤、以下:アートデコ)が提供するレディースファッション通販「GRL(グレイル)」の公式サイトと公式アプリに、DearOneが日本総合代理店を担う行動分析ツール『Amplitude(アンプリチュード Amplitude 分析チャートご案内 https://growth-marketing.jp/amplitude/)』を、また公式サイトには同じくDearOneが国内唯一のパートナーであるカスタマーエンゲージメントツール『MoEngage(モエンゲージ https://www.moengage.com/)』を導入しました。


■行動分析ツール『Amplitude』と、カスタマーエンゲージメントツール『MoEngage』導入の背景・課題
アートデコでは、マーケティングにおけるデータ活用において以下3点の課題があり、これらの課題解決のため、行動分析ツール「Amplitude」とカスタマーエンゲージメントツール「MoEngage」の導入を検討しました。
[画像2: https://prtimes.jp/i/2473/138/resize/d2473-138-ed9b951d683dde9c1e4c-1.png ]

会員登録後に商品を購入した人と、購入していない人のWebサイト上での行動の違い
会員登録後に購入したユーザーにだけ見られる特徴的な行動の発見
会員登録して商品を購入した人のポイント利用傾向

ロイヤルユーザーと一般ユーザーの購入点数の違い Amplitude 分析チャートご案内
ロイヤルユーザーが購入する割合が高い商品の発見
ロイヤルユーザーのサイト利用間隔
ロイヤルユーザーだけに見られる特徴的な行動の発見


■今後の『Amplitude』『MoEngage』の活用方針
アートデコでは今後、Amplitudeを活用して、送料無料期間やノベルティプレゼント実施期間との差異等のデータを比較検討し、MoEngageを活用してメッセージ表示を行うなど積極的にマーケティング施策を実施していく予定です。
DearOneは、分析やエンゲージメントツールの導入・運用だけでなく、プラットフォームとしてのアプリ制作からツール導入後の運用支援までGRLサイト・アプリ全体のグロース支援を一気通貫で行なっていきます。

■MoEngageをご紹介するウェビナーを開催
「MoEngage」の日本上陸を記念して、カスタマーエンゲージメントツールの活用方法や、MoEngageについてご紹介するウェビナーを開催いたします。
日本でMoEngageの情報が聞けるのは本ウェビナーのみとなりますので、ご興味のある方はぜひ、以下のページよりお申し込みください。

APACエリアNo.1のカスタマーエンゲージメントツール「MoEngage」日本上陸!
日程:2022年6月30日(木)
時間:16:00~17:00
会場:オンライン(zoomウェビナー)
参加:無料(事前登録制)

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芸能・芸術・スポーツが一つのトラックに集結。舞踏家、気鋭のダンサー、義足のパラ陸上選手、10代のプロスケートボーダー、日本の奇祭、和太鼓のリズムなどが、落語の口上に合わせて次々に登場する。AR技術を活用した特設アプリや、THEATRE for ALL で独占配信される。
また、人体データの視点から文化を記録・記憶するアーカイブ実践プロジェクトと、一大リレー式カンファレンスも開催。3Dデータやモーションキャプチャーなどの技術で生まれる新たなアートやパフォーマンスの可能性を探る。

【 公開記念・ジャンル横断型リレー方式カンファレンス SSD 2TB iMac 27インチ Retina 5K Mid 2017(19

トークゲスト:アオイヤマダ / 加勢鳥 / 男性ブランコ / 前川楓 / 前田順康(鼓童) / 村松卓矢(大駱駝艦)蓮沼執太 / 水野祐 他

THEATRE for ALL で独占配信(無料)

英語字幕 / バリアフリー日本語字幕 / 音声ガイド

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川田十夢(総合演出)

1976年熊本県生まれ。10年間のメーカー勤務で特許開発に従事したあと、やまだかつてない開発ユニットAR三兄弟の長男として活動。新著『拡張現実的』(2020)、 旧著『AR三兄弟の企画書』(2010)。WIRED巻末連載、J-WAVE 『INNOVATION WORLD』、BSフジ『AR三兄弟の素晴らしきこの世界』、テクノコント。BTC(ブレインテックコンソーシアム)理事。公私ともに長男。通りすがりの天才。その世界のスター。ニュー文化人。

AR三兄弟(開発)

長男 川田十夢、次男 髙木伸二、三男 オガサワラユウによる、やまだかつてない開発ユニット。から、とくにAR(拡張現実)に関するネタを連続的に発表。芸能から芸術まで、長渕剛からロマンスカーミュージアムまで。その拡張範囲はブラックホールのように、東京でいうと東急ハンズ渋谷店のように広大である。

蓮沼執太(音楽)

音楽家、アーティスト。1983年、東京都生まれ。蓮沼執太フィルを組織して、国内外でのコンサート公演を開催する。映画、ドラマ、舞台、ファッションなど、多くの音楽制作を展開している。また個展形式での展覧会、プロジェクトを行っている。2014年にアジアン・カルチュラル・カウンシル(ACC)グランティでアメリカ・ニューヨークへ。 2017年に文化庁・東アジア文化交流使に任命され中国・北京へ。主な音楽アルバムに『NHK DRAMA “KIREINOKUNI” Amplitude 分析チャートご案内 ORIGINAL SCORE』(2021)など。主な展覧会に『Compositions』(Pioneer Works, NY、2018)、『 ~ ing』(資生堂ギャラリー、2018)など。第69回芸術選奨文部科学大臣新人賞を受賞。

出演アーティスト(アイウエオ順)

1. 動画を見る

THEATRE for ALL に会員登録すると無料で視聴できます。

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公開記念・ジャンル横断型リレー方式カンファレンス

「バーチャル身体の祭典 VIRTUAL NIPPON COLOSSEUM」プロジェクト発表会を開催!

プロジェクトの参加アーティストや、 身体や文化財のデジタルアーカイブ、バーチャルイベントに関する有識者の方々をお招きして、リレー式での一大カンファレンスを実施します。AR三兄弟の演出による作品「バーチャル身体の祭典 VIRTUAL NIPPON COLOSSEUM」の制作舞台裏やアプリの楽しみ方のご紹介をはじめ、「デジタル身体データ」の保存と利活用をテーマにした作品制作の可能性や活用事例、今後の可能性などについても話し合います。

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CRYO ARM™ 200 (JEM-Z200FSC) 電界放出形クライオ電子顕微鏡

CRYO ARM™ 200 (JEM-Z200FSC) 電界放出形クライオ電子顕微鏡

The highest resolution 1.53 Å achieved by Amplitude 分析チャートご案内 cryoEM 2019.02

mouse apoferritin


Phenylalanine


Methionine sulfur atom


Tryptophan

  • Optics features: Cold FEG 300 kV & Ω-type energy filter Amplitude 分析チャートご案内 with 20 eV slit width
  • Detector: Gatan K2 (image pixel size: 0.495 Å, mag x100,000)
  • Grid: Quantifoil 1.2/1.3 Cu 200 mesh, kept in the autoloader for 3 days before data collection
  • No. of micrographs: 974 collected over 24 h, 840 used for image Amplitude 分析チャートご案内 analysis
  • No. of particles: 120,295 used for final reconstruction
  • Software: RELION 3.1b, CTFFIND4
  • Resolution: 1.53 Å (B-factor: 47)
  • Note: the first 56 images alone produced a map of 1.76 Å resolution (B-factor: 45)

Mouse apoferritin plasmid from Yanagisawa, Danev & Kikkawa @Tokyo University

Kato, Makino, Nakane, Terahara, Kaneko, Shimizu, Motoki, Ishikawa, Yonekura & Namba 2019.02 (EMDB-9865)Amplitude 分析チャートご案内

ß-galactosidase

β-galactosidase 2.43 Å resolution CRYO ARM™

この図は大阪大学大学院生命機能研究科の難波啓一特任教授、加藤貴之助教らの研究チームによって、加速電圧200kV、Schottky型 FEG搭載のクライオ電子顕微鏡 CRYOARM™で解かれたβ-galactosidaseの構造です。
本データをフーリエシェルコリレーション法にて検証した結果(グラフ)、3D再構成像にて2.43Åという優れた分解能を示しました。

CRAFT(Complete Reduction to Amplitude Frequency Table)

  • Sample:
    β-galactosidase with PETG
  • Microscope:
    CRYO ARM™ (Schottky 200 kV) / K2 summit
  • Number of Images:
    2,500 over Amplitude 分析チャートご案内 3 days by JADAS
  • Image pixel size:
    0.8 Å/pixel
  • Number of particle images:
    350,000(Initial pickup), 88,564 (for final 3D reconstruction)
  • Software:
    Motioncor2, Gctf, Gautomatch, Relion2.0
  • Total dose:
    70 e-/Å 2 (70 frames (0.2 sec/frames x 14 sec)

Data: courtesy by Dr. T. Kato and Dr. K. Namba, Osaka University, August 2017

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